单病毒示踪（Single Virus Tracking）技术用于观察病毒在宿主细胞内实时、原位、动态的侵染过程，揭示单个病毒进入细胞的方式、与宿主细胞的相互作用等机制，对于理解病毒的生命周期和感染机制具有重要意义。荧光材料、标记方法、荧光显微成像和图像处理技术的不断更新迭代，为单病毒示踪领域的发展提供了更多的可能性。
近日，中国科学院深圳先进技术研究院马英新课题组综述了单病毒示踪的最新研究进展，并对单病毒示踪技术面临的挑战、新趋势和方向做了展望。该文章以题为“单病毒示踪”发表在《中国科学·生命科学》上。
文章上线链接：https://www.sciengine.com/SSV/doi/10.1360/SSV-2023-0070
首先，我们系统地总结了单病毒示踪所用的荧光材料和标记方法。性能优异的荧光探针是单病毒示踪的材料基础，主要包含有机荧光染料、荧光蛋白和量子点等。有机荧光染料具有尺寸小、易合成和生物相容性好等优点，但光稳定性差、成像空间分辨率低，限制了单病毒示踪的准确性与灵敏度。通过基因工程手段改造获得不同颜色的荧光蛋白，便于融合表达、通用性强，但同样存在光稳定性差、成像空间分辨率低等问题，无法实现长时间示踪成像。量子点具有荧光强度高、抗光漂能力强、单一激发多元发射等优势，已被广泛用于病毒标记与成像。
图1 荧光标记材料用于单病毒标记的发展概述
其次，介绍了应用于单病毒示踪领域不断迭代的成像装置与图像处理技术。成像装置决定了所采集图像的信噪比和时间分辨率等参数。成像分辨率的提高可以实现对病毒各组分动态行为更加深入的解析，有利于推进侵染机制的探究和相关抗病毒药物的开发。高性能荧光材料的开发和人工智能技术的迭代也将进一步推进超高分辨率显微镜在单病毒示踪领域中的应用。图像处理技术为分析病毒的运动轨迹、速度和颗粒间的相互作用等提供了重要保障。单病毒示踪的成像数据分析通常包含颗粒定位和轨迹分析。颗粒定位的主要方法有质心法和高斯拟合法。病毒颗粒运动轨迹分析的主要步骤有颗粒定位、轨迹连接、轨迹分析和数据可视化。对病毒颗粒的运动轨迹分析可以获取病毒的运动速度、扩散系数、颗粒间相互作用等信息。通过病毒颗粒的运动轨迹分析，可以获得关于病毒传播、感染机制等方面的重要信息，进而提供对抗病毒的策略和方法的启示。
随后，对单病毒示踪研究现状与趋势做了总结归纳。单病毒示踪通过对病毒进行荧光标记，凭借光学显微系统原位实时观察病毒对宿主细胞的侵染过程，获取病毒与宿主间相互作用的动态信息。近年来，材料科学、分子生物学和光学等方面的进步促进了该领域的快速发展，相关研究已涉及到病毒侵染的整个生命周期，包括病毒入胞、胞内运输、病毒脱壳、逆转录与整合、组装与出芽。
图2 单病毒示踪技术用于病毒生命周期解析研究。
最后，总结展望了目前单病毒示踪存在的主要挑战及可能的解决方案。首先，标记材料，如荧光蛋白、量子点等，由于尺寸较大会在不同程度上影响病毒的侵染能力及宿主的相互作用；目前，常用的荧光探针的发射波长主要处于可见光范围，存在成像背景较高、穿透深度有限等问题。开发高性能、小尺寸的近红外二区纳米荧光材料有望解决上述问题。其次，对于病毒与宿主分子层面间相互作用的解析需要依赖更高的时空分辨率。多色荧光标记技术的开发及超高分辨显微技术的发展有效提高了示踪的时空分辨率，大数据分析获取了多维度的信息，为提高病毒-宿主互作解析的准确性带来了更多可能。最后，活体的复杂性限制了单病毒示踪在该方面应用。近红外二区成像探针的开发为活体成像提供了重要的材料保障；同时，基因编辑技术的发展促进了病毒活体模型的构建，二者的有机结合有望推进单病毒示踪在活体层面的发展。