12月13日，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所马英新课题组和西北农林科技大学郁尧博士合作在ACS Sensors上发表了题为《Programmable Aptasensor for Regulating CRISPR/Cas12a Activity》的封面文章。本研究开发了一种基于CRISPR/Cas12a系统的可编程适配体传感器检测平台，主要包括适配体识别元件和CRISPR/Cas12a信号转导及放大元件。该平台无需调整crRNA，只需简单地改变适配体序列和locker DNA长度即可实现不同目标物检测。当以SARS-CoV-2 S蛋白和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)作为特异性靶标进行检测时，检测限分别为0.06 pM和0.06 μM。该平台与侧流免疫分析相结合后能够在一个小时内实现可视化检测，展现了其作为便携式检测的潜力。
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文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssensors.3c01881
近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）系统以其操作简单、携带方便、特异性高等优点，广泛应用于分子诊断。CRISPR RNA (crRNA)与靶标DNA结合后，能够激活Cas12a的顺式切割活性，对靶标双链DNA的特异性位点进行切割，并能进一步对环境中游离的单链DNA进行非特异性切割，产生荧光信号。然而，由于CRISPR系统无法直接识别蛋白质或小分子，因此依赖信号转导策略来建立连接。适配体是一种对靶标具有高度亲和力和高特异性的稳定的DNA或RNA分子，能够将靶标的识别转化为信号的输出，具有稳定性好、制备成本低、靶标范围广等优点。适配体在生物传感中的应用有效地克服了基于CRISPR系统的免疫分析的局限性。
基于此，团队开发了一种基于CRISPR/Cas12a系统的可编程适配体传感器检测平台，并筛选得到了最佳长度的locker DNA，用于蛋白质和小分子的检测。如图1所示，当该平台主要包括一段由适配体序列、locker DNA和crRNA识别序列互补杂交而成的单链DNA发夹结构，通过T4 DNA聚合酶的聚合作用将茎环结构延伸，激活CRISPR/Cas12a的反式切割活性并产生荧光信号；当与靶标物（SARS-CoV-2 S蛋白或ATP）特异性结合后发生构象变化，T4聚合酶无法正常延伸，从而降低CRISPR/Cas12a产生的荧光信号，最终实现对蛋白质和小分子的高灵敏检测。
图1 适配体传感器检测平台的设计原理
在这项研究中，团队首先选择SARS-CoV-2 S蛋白和ATP作为特异性检测靶标，用于评估开发的适配体传感器检测平台进行蛋白质和小分子分析的可行性。实验结果表明，该平台可以有效地识别靶标物，并能通过适配体的构象变化调节Cas12a的切割活性。随后，团队对适配体传感器进行结构优化，当locker DNA长度分别为7nt和4nt时，适配体与靶标物结合后能发生稳定的构象变化，并获得最佳信噪比。利用该平台检测SARS-CoV-2 S蛋白时发现，随着S蛋白浓度逐渐增加，荧光信号逐渐下降且信噪比呈现稳定的线性关系（如图2A-C），检测效果优于商用ELISA检测试剂盒（如图2D）。此外，当与其他非靶标蛋白同时检测时，该平台也对S蛋白展现出良好的检测特异性（如图2E）。在与阴性样本VSV-G假病毒进行实验对照时，SARS-CoV-2假病毒产生显著的荧光变化，表明该平台在检测实际样本时的100%准确性（如图2F）。在改变不同的适配体序列和locker DNA长度后，可以同样的检测效率实现对ATP的高特异性检测，进一步验证了该平台的检测稳定性。最后，团队还将该平台与侧流免疫层析技术相结合（如图3），在一小时内实现了对靶标物的可视化检测，证实了其在POCT中的潜在应用。
适配体传感器检测平台结合靶标物和适配体的高亲和力结合作用及CRISPR/Cas12a系统的高效信号转导和输出功能，实现了对蛋白质/小分子快速且灵敏的检测。同时，该检测平台为提高适配体传感器的通用性和易操作性提供了新的见解。
图2 适配体传感器用于SARS-CoV-2 S蛋白的分析
图3 适配体传感器检测平台与侧流免疫层析相结合
西北农林科技大学郁尧博士、中国科学院深圳先进院与天津科技大学联合培养硕士研究生李巧玉为文章的并列第一作者。中国科学院深圳先进院合成生物学研究所的马英新研究员和毛国斌副研究员为该论文的共同通讯作者。
该项目得到了国家自然科学基金、科技部、中国科学院、广东省、深圳市及深圳合成生物学创新研究院等多个项目的支持。
补充封面图（supplementary cover story）
基于CRISPR/Cas12a系统的可编程适配体传感器