近日，美国明尼苏达大学Michael Travisano，Romas J. Kazlauskas和易啸（现为中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所研究员）以共同通讯作者身份在Science Advances发表文章“Plasmid hypermutation using a targeted artificial DNA replisome”。团队设计了一种靶向人工DNA复制体(targeted artificial DNA replisome，TADR)的蛋白质复合物，可在胞内对质粒的一条链进行易错复制。它可以使靶质粒的突变率提高2.3×10^5倍。TADR也可以同时进行多种碱基替换，为解决分子进化中的难题、开发生物药物和工业催化剂提供了潜力。
自然进化极其复杂，它取决于种群规模、突变率和适应性景观的形状。由于自然界的进化要持续几十年或更长时间，因此很难研究制造医药和工业用新酶。为了改进或产生新的分子功能，科学家需要在大量种群内体内进化，以探索广泛的蛋白质序列空间。理想的体内诱变工具需具有以下三个特征：(1)突变目标区域不少于一个基因，低无关诱变；(2)具有较高的突变率，随开随关，突变涵盖所有类型的核苷酸替换；(3)易使用，无限制性特征。目前，还没有工具能够满足所有这三个需求。
而TADR作为可以解决这一问题的工具，可以针对体内特定位点的强化突变，例如携带感兴趣蛋白质基因的质粒。一毫升过夜细菌培养物携带数十亿个细胞——突变体库的理论大小，而定向进化实验依赖于易错聚合酶链反应 (PCR) 的体外化学，通过汇集来自许多电穿孔的菌落，使用的变体不超过数百万。靶向特定位点可防止其他地方的有害突变掩盖目标上的有益突变。增强的诱变可将进化速度从几十年加速到数小时。
团队利用病毒切口酶、细菌Rep解旋酶和易出错DNA聚合酶的三蛋白复合物进行体内靶向突变，以复制带有错误的目标质粒的一条链。这种靶向人工DNA复制体（TADR）满足上述靶向性、诱变性和灵活性三个要求。它的简单设计将它对自然细胞过程的干扰降至最低，但其复杂程度又足以将所有种类的点突变（共十二种）靶向到完整基因甚至基因簇上。
图|靶向易出错的人工DNA复制体
（A） TADR的两个组分：来自PhiX174的cisA（切口酶，左）、噬菌体T5的T5 DNA聚合酶与大肠杆菌的Rep螺旋酶的融合蛋白（右）。(B） 人工复制体体内靶向诱变的拟议步骤。详见正文。(C） 人工复制体中蛋白质的拟议排列。(D） 外力对Rep螺旋酶（橙色）释放DNA的速度影响不大，但会减慢T7噬菌体DNA聚合酶（红色）
首先，作者将易错的T5 DNA聚合酶与宿主Rep解旋酶通过连接肽相连接。由于距离更近，T5DNA聚合酶应能优先于宿主DNA聚合酶在复合体中发挥功能，引发突变。设计的TADR包括三组分：在染色体上型表达的CisA；辅助质粒，阿拉伯糖启动子控制表达T5 DNA聚合酶与Rep解旋酶的融合蛋白；目标质粒，在目标基因首尾放置了CisA识别起始与终止序列。以防干扰，宿主Rep解旋酶基因被敲除。之后，作者使用因A785C碱基突变而功能丧失的卡那霉素抗性基因作为目标基因，逆转该突变则可恢复细胞抗性。通过对照试验，发现TADR的突变率以及特异性仍需优化。因此，作者通过自进化易出错的T5DNA聚合酶及增加其表达量来增加突变率；通过删除Rep解旋酶中与宿主固有复制体结合的C端33个氨基酸等优化来增加选择性；还发现在基本培养基中诱导突变比丰富培养基能更好的降低脱靶突变。最终，TADR突变率增加了2.37 × 10^5倍，选择性提高了3060~5970倍。最后，作者进化四环素外排泵以赋予其替加环素抗性，经过两轮诱变选择，在替加环素(8 ng/μl)中的生长速率是野生型泵的16倍。
研究证实了TADR在其单个组分的活性方面的设计，然后在优化后证明了其高性能：TADR将高突变导向目标质粒，以发现基因的特定单突变或双突变，同时避免染色体上的突变。TADR总结有以下功能：
（1）TADR足够复杂，可以满足不同的功能需求。
（2）TADR足够简单，可以模块化：理论上可以组装在任何物种的细胞里。
（3）TADR可以进一步优化。
未来我们有望看到TADR在更多领域的应用。
文章链接：
https://advances.sciencemag.org/content/7/29/eabg8712/tab-figures-data
易啸，博士，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所研究员。本科毕业于中山大学生物基地班，后赴美留学。师从明尼苏达大学分子进化学家Antony Dean教授，学习种群遗传学及生态学。博士期间与导师合作，发展了一套关于生物多样性的新理论并通过实验提供证据：传统认为对生物多样性形成不重要的季节变化其实能够很好的解释物种共存。博士后期，对生命现象的物理和分子机制发生兴趣，尝试独立探索进化过程和功能机制的关系。最终成功构建实验系统，捕捉到一个新行为的起源并阐明机制，为研究行为进化提供了一种新思路。博士后期间，兴趣延申到工程应用：如何利用进化过程？构建出一个实验平台，实现在活细胞内快速进化目标蛋白质。接下来，希望应用此系统来解决科研或生产的问题。
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