运用合成生物学方法构建模块化的细菌同步化器 子细胞机器Baby Machine

2019年4月13日,刘陈立课题组在合成生物学专业期刊《ACS Synthetic Biology》发表了题为“Microfluidic synchronizer using a synthetic nanoparticle-capped bacterium”的封面文章,结合人造磁细菌和微流控技术建立细菌同步化器(子细胞机器)。

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为什么要 “同步化”细菌?

细胞周期是生命活动中的一个重要过程,与细胞的生长、繁殖和分化息息相关。在细胞周期的调控下,细胞持续生长,并在适当的条件下分裂形成两个相似的子细胞。在这一过程中,最令人惊讶的是细胞的每次分裂都能对应一次DNA复制,从而确保每个子细胞都有一套完整的基因组。随着细胞周期的进行,一系列与细胞周期相关的事件分别在细胞周期的特定阶段有序的进行。细胞周期的研究对于揭示细胞生长和繁殖的内在调节机制至关重要。(图 1)。

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图 1细菌的细胞周期是一个复杂的生理过程6

然而,半个世纪以来,人们还不清楚细菌到底是如何完成和控制其整个细胞周期的。在同一培养条件下,成千上万自由生长的细菌的细胞周期无法统一,这种无序的情况,让我们无法了解细胞在一个分裂周期的不同阶段都干了什么?这其中的制约因素是我们很难把在一个细胞周期不同阶段的细菌细胞分离并收集起来进行分析。如果要知晓确切的定量某种细菌某个细胞周期下的分子组成和代谢情况,就必须要让这些细菌从同一起跑线开始生长,也就是“同步化”,否则,收集的细胞群内的细胞周期分布各不相同,分析也就无从下手。如何让这些细胞“定在某一时期”?或全部从同一时间开始生长呢?(图 2)

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图 2 所有细胞Freeze!我要开始检查了!

细菌同步化器——baby machine

1956年,Barner与Cohen已经尝试着获得同步化分裂的细菌细胞1。他们利用了一种胸腺嘧啶合成缺陷的大肠杆菌突变株,通过去除培养基中额外添加的胸腺嘧啶,可以阻断这株菌的DNA合成。在缺乏胸腺嘧啶的培养基中培养一段时间后,重新添加胸腺嘧啶可以激活DNA的合成以及随后的细胞分裂,从而获得同步化分裂的大肠杆菌。同样是在1956年,Maruyama和Yanagita采用物理的方法将细菌细胞分离为成熟和不成熟的两部分5。然而,通过使用这些化学阻断剂和物理分离方法使细胞同步化获得的同步化细胞与正常生长的细胞状态是不一致的,同步化的过程总是会扰乱细胞周期的进展,从而引入一些与细胞周期不相关的因素。是否存在能让细胞年龄从无序到有序的方法呢?1958年,一个有志成为放射生物学家的博士研究生Charles E. Helmstetter(现就任佛罗里达理工大学,生物科学系)也遇到了相同的问题,为了观察在放射过程中大肠杆菌细胞周期受到的干扰情况,他必须将这些细菌“同步化”,即让这些细菌从同一时刻开始DNA复制、细胞分裂等代谢过程。毫不意外,开始的时候他接连失败,这种探索从一直维持了近10年(详细的描述可见于3),直到他设计出一个过滤器,将细菌吸附在滤网上,通过用大量的培养液冲刷滤网,将新生的细菌被培养液冲掉,而“老年细菌”还挂在滤网上(图 3),然后把这些细菌富集起来进行镜下观察,发现新生细菌不仅大小一致且分裂时间也相同。经过不懈努力,他终于收集到了无干扰的同步化细菌,此滤网设备被命名为 baby machine。至此以后,很多同步化器都基于这一思路进行了后续改进。例如,某些同步化器通过利用某些细菌的鞭毛结构,将细菌卡在滤网上或栅格内;有一些同步化器则利用新生菌的强游动能力来同步化新生细菌,然而这些利用细菌特征的方法适用性窄,无法广泛应用于其他细菌种类;还有人建立了针对哺乳动物细胞的同步化器。但所有这些传统方法都需要大流体冲刷母细胞,这样获得的同步化细菌群体密度低,多混有母细胞,并且研究人员需要用离心等方法收集目标细菌baby,人为操作的干预增加了从收集到分析的时间间隔,也干扰了细菌的同步化状态。

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图 3细菌baby machine同步化器漫画示意3

造一个全自动的baby machine

如何缩短收集时间,或如何将这种baby machine自动化呢?

“合成生物学”是一门定量的工程学研究,在精确定义的基础上,合成生物学工作者可以将生物的组成模块化(复制模块,翻译模块,运输模块等,就好像汽车上的一个个零件),再根据具体的应用环境集成化。另一方面,利用微流控芯片技术可对微尺度下的流体或粒子进行控制。在一块微流控芯片中,可以将生物、医学、化学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到厘米甚至毫米级芯片上,从而实现对微流体中的细胞、蛋白质等物质进行操控、检测与分析2。微流控芯片技术具有耗材少、响应快、集成度高等优点(图 4)。同时,这种芯片技术也可以模块化、集成化。

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图 4掌上实验室

我们设想造出一个集成“微流控+合成微生物”的细菌同步化器,并设想通过模拟天然趋磁细菌来实现。天然趋磁细菌,这种细菌大部分为厌氧或兼性厌氧菌,其能够在菌体内合成磁性纳米晶体(包含四氧化三铁,硫化亚铁等高纯度纳米颗粒),称为磁小体,多个磁小体能在细胞内排列成一条或多条长链,组成一个“磁场感应器”。4(图 5)。

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图 5天然趋磁细菌4

基于合成生物学研究思路,受天然趋磁细菌趋磁性特点的启发,选择大肠杆菌,利用生物素+亲和素的原理,将磁颗粒装载到细菌上。我们构建了一种能在菌体端点表达eGFP-AIDA重组融合蛋白的大肠杆菌工程菌,再通过生物素化的蛋白抗体介导融合蛋白和亲和素标记的纳米磁颗粒相连,使纳米磁颗粒附着在菌体的端点,得到一种人工磁细菌。由于吸附位置特殊,所有的细菌都是两头带着颗粒,经过一次分裂后这些细菌只有一侧带有磁颗粒。(图 6)

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图 6 人造磁细菌电镜和荧光显微镜结果

我们将这种细菌称为mother cell,mother cell被磁力吸附装载到微流控通道里。这样,一个迷你微流控细菌同步化器就造好啦。(图 7)

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图 7微流控baby machine Ver 1.0实物图和侧方示意图

生产同步化的baby cell

当需要收集同步化细菌的时候,我们可以将微流控芯片置于37℃温控装置上,通入培养液,短暂细菌活化之后,新生的细菌随之产生。由于新生细菌并没有磁力,不会被外部磁铁所吸附,如此一来,新生的细菌会被冲出通道到达收集池,两分钟左右,就约有10万个同步化的细菌被收集,无需离心等进一步处理即可直接用于后续研究。由于流速很快,一个新生的细菌最多只需要30秒就可以从通道中被冲到收集池;同时,微流控的通道体积小,一次收集只需要很少量培养液(包括洗液约2 ml),较少的收集体积可以在不用离心的情况下直接进行下一步实验,这在很大程度上减少了后续人工操作对细胞的影响。通过对这些收集下来的细菌实施进一步的同步化鉴定,可以发现它们分裂的时间非常同步,而且这种同步化可以保持两到三个周期(图 8),这种水平的同步化可以确保后续分析鉴定实验的稳定性和可重复性。

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图 8 细菌同步化鉴定

展望

微流控技术结合人造磁细菌的Baby machine越过了之前同步化方法中对细菌的限制条件(细菌的大小,有无鞭毛等),从一个崭新的角度为细菌、原核生物乃至真核生物的同步化提供了思路和解决方案。通过外源装载磁颗粒的方法,理论上可以将所有物种的母细胞吸附在磁场范围内,从而将母细胞和子细胞彻底分离;同时,微流控高流速的特点保证了子细胞的出生时间几乎一致,也就保证了子细胞的同步化性。目前采用的磁细菌方法仍然有些繁琐,这并不利于方法的普适化以及后续应用,同时,提高单位时间内的产量及寻找更好的办法避免细菌或细胞的非特异性粘附,是后续待解决的工程问题。

相对于传统的baby machine,这款新型的微流控baby machine解决了人为操作干扰结果的痛点,在减少培养液用量的同时也提高了单位体积内的细菌密度。此外,这种微流控细菌同步化器芯片还可以集成到后续的微流控自动平台,构成“设计——生产——检测——分析”自动平台的关键一环。我们将通过该设备获得细菌在不同细胞周期中的转录组,蛋白质组及修饰组学等组学信息,这将极大增进我们对“细菌如何控制细胞周期”这个半个世纪来悬而未决的谜团的理解。

(*本研究受到国家自然科学基金、中科院重点部署项目、博士后创新人才支持计划等项目的支持;

*未标注来源的图片均为网络图片,出处不可考,如有侵权,请与我司联系。)

主要参考文献:

1 H. D. Barner, and S. S. Cohen, 'Synchronization of Division of a Thymineless Mutant of Escherichia Coli', J Bacteriol, 72 (1956), 115-23.

2 E. W. Esch, A. Bahinski, and D. Huh, 'Organs-on-Chips at the Frontiers of Drug Discovery', Nat Rev Drug Discov, 14 (2015), 248-60.

3 C. E. Helmstetter, 'A Ten-Year Search for Synchronous Cells: Obstacles, Solutions, and Practical Applications', Front Microbiol, 6 (2015), 238.

4 W. Lin, G. A. Paterson, Q. Zhu, Y. Wang, E. Kopylova, Y. Li, R. Knight, D. A. Bazylinski, R. Zhu, J. L. Kirschvink, and Y. Pan, 'Origin of Microbial Biomineralization and Magnetotaxis During the Archean', Proc Natl Acad Sci U S A, 114 (2017), 2171-76.

5 Y. Maruyama, and T. Yanagita, 'Physical Methods for Obtaining Synchronous Culture of Escherichia Coli', J Bacteriol, 71 (1956), 542-6.

6 M. Osella, S. J. Tans, and M. Cosentino Lagomarsino, 'Step by Step, Cell by Cell: Quantification of the Bacterial Cell Cycle', Trends Microbiol, 25 (2017), 250-56.